2012年3月23日金曜日

メチル水銀毒性の発現機構解明とその応用


メチル水銀毒性の発現機構解明とその応用Studies on mechanism of toxicity of methylmercury20032005永沼NAGANUMAAkira東北大学・大学院・薬学研究科・教授基旭東北大学・大学院・薬学研究科・助手大橋一晶大阪大学・大学院・薬学研究科・助手久下周右東北大学・大学院・薬学研究科・助教授Cdc34F-Box蛋白質F-box proteinsRad23methylmercuryresistancetoxicityubiquitinメチル水銀ユビキチン毒性発現機構耐性酵母環境系薬学基盤研究(A)東北大学
一般
205400001950000010660000我々は、Cdc34がユビキチン転移酵素として関与するユビキチン・プロ、テアソームシステムの亢進が酵母及びヒト細胞にメチル水銀耐性を与えることを見出している。本システムにおいて基質蛋白質の認識を担うサブユニットであるF-Box蛋白質は酵母には少なくとも17種存在するが、その中でHrt3およびYlr224wが高発現によって顕著なメチル水銀耐性を酵母に与えることを15年度に見出し、16年度にはHrt3が認識する蛋白質としてDld3およびGrs1を、また、Ylr224wが認識する蛋白質としてEno2を同定することに成功した。17年度にはこれら3つの蛋白質全てがメチル水銀毒性増強作用を有し、さらに、細胞内でユビキチン化された後にプロテアソームで分解されることを明らかにした。Dld3およびEno2は共に細胞内でのピルビン酸の生成経路に関わ� �酵素であるが、ピルビン酸のミトコンドリア中への取り込みに関与するトランスポーターであるYi1006wを欠損させた酵母はメチル水銀に対して耐性を示し、過剰のピルビン酸を酵母またはヒト細胞の培地中に添加することによってメチル水銀毒性が顕著に増強されることも新たに判明した。ピルビン酸の単独添加はメチル水銀毒性に影響を与えないことから、これらの結果は、ミトコンドリア中へのピルビン酸の流入促進がメチル水銀毒性の増強を引き起こすことことを明確に示している。一方、ユビキチン化反応に影響を与えることが知られる細胞内因子の中で、Rad23の高発現が酵母にメチル水銀耐性を与えることを見出した。Rad23によるメチル水毒性軽減にはユビキチン化蛋白質のユビキチン鎖の伸張抑制作用が必須であることから、Rad2 3はある種の蛋白質のユビキチン化を介した分解を抑制することによってメチル水銀毒性を軽減すると思われる。その蛋白質の候補としてPng1が同定された。We have identified a gene, CDC34 that confers resistance to methylmercury in Saccharomyces cerevisiae by screening a yeast genomic DNA library. CDC34 encodes one of the ubiquitin-conjugating enzymes (Cdc34) that catalyze ubiquitin transfer onto substrate proteins, an important step for protein degradation via ubiquitin-proteasome pathway. In yeast cells, the ubiquitin-conjugating activity of Cdc34 is essential for the Cdc34-mediated resistance to methylmercury. It is possible to conclude that proteins involved in expression of methylmercury toxicity might exist in the cells and the proteins are degraded after its ubiquitination in proteasomes. In ubiquitin system, substrate proteins are recognized by F-box proteins and ubiquitinated by ubiquitin-conjugating enzymes. Thus, we searched F-box proteins which confer resistance to methylmercury, and found that Hrt3 and Ylr224w have role in protection against methylmercury toxicity. Proteins that bind to these F-box proteins might have activity to intensify the toxicity of methylmercury. We identified three proteins that bind to the F-box proteins, Hrt3 and Ylr224w. Overexpression of the genes for these proteins conferred a hyper susceptibility to methylmercury. Moreover, these proteins are found to be ubiquitinated in the cells. These results suggest that the F-box protein-bounding proteins identified by the present study have significant roles in expression of methylmercury toxicity and are decomposed by the ubiquitin-proteasome pathway. Two of these proteins are enzymes involved in synthesis of pyruvate, and overexpression of these proteins might increase cellular concentration of pyruvate. Addition of excess pyruvate into the culture medium significantly prevents toxicity of methylmercury. Increase in cellular production of pyruvate might have an important role in enhancement of toxicity of methylmercury.
siRNAによる遺伝子ノックダウン法を利用したメチル水銀感受性決定遺伝子の検索20052005永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授基旭東北大学・大学院・薬学研究科・助手siRNAスクリーニングヒト培養細胞メチル水銀毒性ライブラリー遺伝子ノックダウン環境系薬学萌芽研究東北大学3400000メチル水銀毒性の発現機構は不明のままであり,解明のための糸口さえほとんど得られていない。近年、siRNAを用いた遺伝子ノックダウン法が飛躍的な発展を遂げているが、最近になって約30,000といわれているヒト遺伝子の中で機能の分かっている約8,500の遺伝子を一つずつノックダウンするという画期的な応用例が報告された。そこで本研究では、メチル水銀毒性の分子メカニズム解明を目指し、この最新の報告で用いられたsiRNAライブラリーを利用して、欠損することによってメチル水銀感受性に影響を与えるヒト遺伝子群の同定を試みた。まず、様々な条件下での検討により、至適検索条件を確立した。その方法用いて、ノックダウンによってヒト胎児腎由来培養細胞(HEK293細胞)のメチル水銀感受性に影響を与える遺伝子群を検 索した結果、ornithine aminotransferase、chemokine ligand 2、transglutaminase4、glutamate receptor metabotropic6、regulator of G protein signaling1、TBP-associated factor RNA polymerase II、 enolase 2およびphosphoenolpyruvate carboxykinase 1の8種の遺伝子が同定された。この中でenolase 2およびphosphoenolpyruvate carboxykinase 1は共にピルビン酸合成に関わる酵素であることから、ピルビン酸濃度の変動がメチル水銀毒性に影響を与える可能性が考えられた。そこで、ピルビン酸の培地中への添加がメチル水銀毒性に与える影響をヒト神経芽腫細胞を用いて検討したところ、ピルビン酸がメチル水銀毒性を顕著に増強させることが初めて明らかとなった。痙攣発症におけるメタロチオネインの役割とその応用Role of metallothionein in mechanism of onset of epileptic seizure19981999永沼NAGANUMAAkira東北大学・大学院・薬学研究科・教授西山省二明治製菓株式会社・薬品総合研究所・主席研究員三浦伸彦東北大学・大学院・薬学研究科・助手宮入伸一東北大学・大学院・薬学研究科・助教授CadmiumKidneyMetallothioneinNM31PTZ-17PolymorphismPromoterRenal injuryペンチレンテトラゾールメタロチオネイン痙攣遺伝子欠損細胞遺伝子発現生物系薬学基盤研究(B)東北大学
展開研究
68000006100000核移行蛋白質であるメタロチオネイン(MT)が遺伝子の発現調節に関与している可能性を考え、MT遺伝子欠損マウスおよび正常マウスの肝臓から不死化細胞株を樹立してディファレンシャルディスプレイ法で両細胞間で発現量の異なる遺伝子の検索を試みた。その結果、MT遺伝子欠損細胞で発現が認められない遺伝子(NM31)を見いだした。NM31はペンチレンテトラゾール(PTZ)によって誘発される痙撃発症に関与する遺伝子として報告されているPTZ-17と同一であり、ヒトやマウスの脳で特異的に高い発現が認められる。MTには数種の分子種が知られており、我々が検討に用いたMT遺伝子欠損マウスは肝臓や腎臓中の主要分子種であるMT-1および-2を欠損しているが脳特異的分子種であるMT-3は欠損していない。MT遺伝子欠損マウスの肝臓中ではNM31mR NAの発現が殆ど認められないのに対して、脳中では正常マウスと同様に高度の発現が観察された。また、MT遺伝子欠損細胞にMT-3遺伝子を導入したところNM31遺伝子の発現が確認された。この結果から、脳中においてはMT-3がNM31の発現に重要な役割を果たしているものと考えれる。一方、MTは亜鉛などの重金属によってその合成が誘導されることが知られているが、亜鉛処理によって正常細胞のMT濃度は顕著に上昇したもののNM31mRNAレベルはほとんど変動が認められなかった。したがって、NM31の発現には正常レベルのMTが存在すれば充分であると思われる。さらに、PTZの細胞毒性に対するMT有無の影響を検討したところ,MT欠損細胞および正常細胞との間に有意な差は認められなかった。このことから,NM31の発現の有無は少なくともPTZの細胞毒性には� ��響を与えないものと考えられ、PTZ誘発性の痙れんにはNM31は直接は関与しない可能性が示唆された。Nuclear localization metallothionein (MT) in mammalian cells has been reported, indicating that metallothionein may also be associated with unclear functions. We speculated that MT is involved in gene expression. Genes differentially expressed in association with disruption of the MT gene were screened using two hepatic cell lines isolated and established from the livers of normal and transgenic mice deficient in the genes for MT-1 and -2 (MT-null). We found one cDNA (NM31) that was expressed only in normal cells. The nucleotide sequence of NM31 was identical to the 3' region of PTZ 17, which is related to pentylenetetrazol (PTZ)-induced seizures. Transfecting MT-null cells with the genes for both MT-1 and -2 resulted in NM31 expression. High expression level of NM31 has been observed in the brain of human and mouse. The expression of NM31 was also observed in the brain of MT-null mouse which is containing brain specific Mt isoform, MT-3. When the MT-3 gene was introduced into the MT-null cells, the expression of the NM31 gene was also observed, suggesting an important role of MT-3 in expression of NM31 in the brain. On the other hand, MT is known that the synthesis was induced by heavy metals such as zinc. However, the NM31mRNA level in normal cells was not changed by zinc at a concentration sufficient to induce MT. It seems that MT levels of the normal cell are enough for the expression of NM31. Significant difference of cytotoxicity of PTZ could not be recognized between MTnull-cell and normal. Next, we examined cytotoxicity of PTZ in MT-null cells and normal cells. Significant difference of cytotoxicity of PTZ could not be recognized between these two cell lines, suggesting that NM31 may not be involved in PTZ toxicity.
メチル水銀の細胞内標的分子の解明Investigation of Target Molecules of Methylmercury Toxicity20002001永沼NAGANUMAAkira東北大学・大学院・薬学研究科・教授古地壯光東北大学・大学院・薬学研究科・助手三浦伸彦独立行政法人 産業医学総合研究所・研究員Cdc34GFATMethylmercuryResistanceUbiquitinYeastグルコサミングルコサミン6リン酸メチル水銀メチル水銀毒性ユビキチン培養細胞細胞内標的分子耐性耐性遺伝子酵母公衆衛生学・健康科学基盤研究(B)東北大学
一般
72000006300000我々はL-グルタミン:D-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFAT)が酵母におけるメチル水銀の標的分子であることを明らかにした。そこで,ヒト組織由来の培養細胞を用いてメチル水銀毒性とGFAT活性との関係を検討した。酵母ではGFAT反応の産物であるグルコサミン-6-リン酸を細胞内に供給することによってメチル水銀の細胞毒性が顕著に軽減されるが,今回,HeLa細胞を用いて検討したところグルコサミン-6-リン酸の供給によるメチル水銀毒性の軽減はほとんど観察されなかった。また,ヒト腎由来の293E細胞にGFAT遺伝子を導入したGFAT高発現細胞はメチル水銀耐性をほとんど示さなかった。以上の結果は,少なくともHeLa細胞においてGFATがメチル水銀の標的分子ではない可能性を示唆している。そこで、GFAT以外の分子を検索し� �ところ、ユビキチン転移酵素Cdc34をコードする遺伝子CDC34の高発現が酵母にメチル水銀耐性を与えることが判明した。これまでにユビキチンシステムとメチル水銀毒性の関係に関する報告はないことから、本知見はメチル水銀毒性を考えるうえでも大変興味深い。このCdc34に様々な変異を与えた変異CDC34遺伝子を酵母内で発現させることによって、メチル水銀耐性獲得に必要な機能ドメインの検索を行ったところ、Cdc34のユビキチン転移酵素としての機能がメチル水銀耐性獲得に必須であることが明らかとなった。以上の結果から、ユビキチンシステムはメチル水銀に対する防御因子として重要な役割を果たしているものと考えられ、この機構にメチル水銀の標的分子が関与している可能性も考えられる。Methylmercury is a significant environmental contaminant that will continue to pose a great risk to human health. However, the biochemical mechanism responsible to methylmercury toxicity is not clearly identified. We have reported that L-glutamine:D-fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT) is a target molecule of methylmercury in the yeast. In the present study, the relationship between methylmercury toxicity and GFAT activity was examined in cultured human cells. In yeast, cytotoxicity of the methylmercury is remarkably reduced by overexpression of GFAT or by loading excess glucosamine-6phosphate which is a product of the GFAT reaction. However, the protective effect of loading of excess glucosamine-6-phosphate against methylmercury toxicity was not observed in HeLa cells. 293E cells overexpressing GFAT also hardly demonstrated resistance to methylmercury. These results suggest that GFAT may not be a target molecule of methylmercury at least in HeLa and 293E cells. Thus, we have searched for other genes conferring methylmercury resistance by transforming a genomic library into Saccharomyces cerevisiae. We have identified CDC34 as a methylmercury resistance gene. CDC34 encodes one of the ubiquitin-conjugating enzymes that catalyze ubiquitin transfer onto substrate proteins, an important step for protein degradation via ubiquitin-proteasome pathway. To investigate the mechanism for reduction of the sensitivity of yeast to methylmercury by overexpression of CDC34, we examined the viability of yeast strains overexpressed various CDC34 mutants in the presence of methylmercury. Since CDC34 mutants, cdc34C95A, cdc34E109, D111, E113A or cdc341-170aa, which have been shown to have less or none ubiquitin-conjugating activity, failed to confer methylmercury resistance, ubiquitin-conjugating activity of Cdc34 seems to be essential for the resistance. Cdc34 has an important role not only in yeast but also in humans. These results suggested that ubiquitin-conjugating enzymes may play a critical role on methylmercury resistance in yeast. Cdc34 has an important role not only in yeast but also in humans.
カドミウム毒性に対する遺伝的ハイリスクグループ同定法の開発Identification of a genetically high-risk group for cadmium toxicity20012002宮入伸一東北大・薬学研究科(研究院)・助教授永沼NAGANUMAAkira東北大学・大学院・薬学研究科・教授三浦伸彦独立行政法人産業医学総合研究所・研究員宮入伸一日本大学・薬学部・教授久下周佐東北大学・大学院・薬学研究科・助教授CadmiumCin5High risk groupIndividual differenceMTF1MetallothioneinPolymorphismRenal injuryYdr259cカドミウムシスプラチンパラコートメタロチオネイン個体差耐性遺伝子腎毒性遺伝子多型酵母高感受性集団環境系薬学基盤研究(B)東北大学
展開研究
72000006700000メタロチオネインはカドミウムなどの重金属によってその合成が誘導され、これら重金属と強固に結合してその毒性の発現を抑制する。一般人では、カドミウム毒性の主要標的組織である腎臓中に蓄積しているカドミウムはそのほとんどがメタロチオネインに結合した無毒性の形で存在している.しかし、メタロチオネイン合成に異常がある一群(ハイリスクグループ)が存在する可能性も否定できない。そこで本研究では、メタロチオネイン合成異常の原因として遺伝子変異に着目し、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター領域中での塩基配列異常とメタロチオネイン合成との関係を検討した。健常な日本人119例の白血球から単離したDNAを用いてプロモーター領域の変異をSSCP法により検索したところ、以前我々が見出した転写開� �点(+1)から上流5塩基目(-5)に存在するアデニン(A)からグアニン(G)への一塩基置換のみが今回も認められた。その存在割合は野生型であるアデニンのホモ接合体が98例(82.4%)、アデニンとグアニンのヘテロ接合体が20例(16.8%)、グアニンのホモ接合体が1例(0.8%)であった。この変異部位はTATA boxと転写開始点の間のコアプロモーター領域に存在し、変異型(-5g)プロモーターは野生型(-5A)に比べてZnやCdによる転写活性化効率が有意に低いことも判明した。プロモーター中の変異部位周辺配列をプローブとしてゲルシフトアッセイを行ったところ、変異によって結合量が低下する核内蛋白質が存在することが明らかとなった。一方、プロモーター中に変異のある人々を簡便に同定する方法を検討し、変異によって制限酵素BsgI切断部位が消失することに着目した切断断片長測定法を確立した。本法を用いてカドミウム毒性に対するハイリスクグループを同定することにより早期予防が可能になるものと期待される。Metallothionein (MT), the synthesis of which is induced by heavy metals such as cadmium (Cd), binds tightly with these heavy metals and suppress their toxicity. In healthy people, Cd mainly accumulates in the kidney, which is the primary target of Cd toxicity, and is present as MT-bound non-toxic forms. However, the possibility of the presence of a group of people with abnormalities of MT synthesis (high-risk group) cannot be excluded. In this study, therefore, we directed attention to gene mutations as possible causes of abnormal MT synthesis, and evaluated the relationship between abnormal base sequences in the promoter region of MT gene and MT synthesis. When we examined mutations of the promoter region using DNA isolated from white blood cells of 119 healthy Japanese people by the SSCP method, only the one-base substitution from adenine (A) to guanine (G) at the 5th base upstream (-5) of the starting point of transcription (+1), which we detected before, was observed again. Concerning the frequency of its occurrence, the homozygote of adenine, which is the wild type, was observed in 98 subjects (82.4%), heterozygotes of adenine and guanine were observed in 20(16.8%), and the homozygote of guanine was observed in 1(0.8%). This mutant site was present in the core promoter region between TATA box and the starting point of transcription, and the mutant promoter (-5G) had significantly less transcription activating efficiency by Zn and Cd than the wild type (-5A). We also evaluated a simple method for identification of people with a mutation in the promoter and established the fragment length measurement method based on the disappearance of the site that is cut by the restriction enzyme BsgI due to mutation. This identification of a high-risk group for Cd toxicity by this method may allow early prevention of Cd poisoning.
シスプラチンの細胞毒性発現に関与する蛋白質の同定とその機能解析20012001永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授古地壯光東北大学・大学院・薬学研究科・助手三浦伸彦独立行政法人産業医学総合研究所・研究員Cin5Ydr259cシスプラチンパラコート耐性遺伝子酵母特定領域研究(C)東北大学4200000酵母にシスプラチン耐性を与えることを我々が見出した機能未知の転写因子様蛋白質Cin5およびYdr259cは相同性が高く、同じ機構でシスプラチン耐性に関わると考えられる。両蛋白質は共に他の転写因子との相互作用により遺伝子発現を抑制する作用を有する可能性が示唆されたことから、DNAマイクロアレイ法を用いてCin5またはYdr259cによって発現が抑制されている遺伝子群を検索したところ6種の遺伝子が見出された。これら6種の遺伝子をそれぞれ欠損した酵母はどれもシスプラチン耐性を示さなかったが、そのうちの一つであるSpt7を欠損した酵母がパラコートに対して強い耐性を示した。Cin5およびYdr259c高発現酵母も同様にパラコート耐性を示したことから、Cin5およびYdr259cが他の遺伝子の発現を抑制することによって酵母に薬毒� ��耐性を与えるという我々の仮説が強く支持された。一方、シスプラチン処理による発現レベルの変動パタ-ンが野生型酵母と比べてCin5またはYdr259c高発現酵母で大きく異なる遺伝子を同様に検索した結果、シスプラチン処理によって野生型酵母では発現量が減少し、Cin5およびYdr259c高発現酵母では上昇する遺伝子として鉄の取り込みに関与する蛋白質をコードする遺伝子8種類が同定された。これら遺伝子のうちFIT1、FIT2、TAF1およびYKR106wを高発現させた酵母にシスプラチン耐性が認められ、Cin5およびYdr259cが鉄の取り込みに関与する複数の遺伝子の発現を直接または間接的に促進することによって酵母にシスプラチン耐性を与える可能性がはじめて示唆された。このような機構がヒトがん細胞中にも存在してシスプラチン耐性に関わっている� �能性も十分考えられる。メタロチオネインのアミノ酸置換が引き起こす影響20032003永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授
薬用CCSは何ですか
jp/ja/r/70344679">大橋一晶東北大学・大学院・薬学研究科・助手siRNAカドミウムノックダウン細胞メタロチオネイン遺伝子多型衛生学萌芽研究東北大学3300000カドミウム毒性に対する防御蛋白質としてメタロチオネインが知られている。我々はメタロチオネインの遺伝子多型を検討し、転写開始地点の上流5塩基目とエクソン3領域に多型の存在を明らかにした。さらにエクソン部に塩基変異の認められた全例が転写開始地点上流にも変異有することも判明した。両多型の存在率から推定すると、この結果を偶然とは考えにくい。そうであれば、エクソン部と転写開始地点上流の両方に塩基変異のある人間は成人まで成長することができるが、エクソン3にのみ変異を有する個体は何らかの理由で生まれてこないか、生まれたとしても成人になる前に死亡してしまうという可能性が考えられる。そこで本研究は、変異型のメタロチオネインが細胞増殖に与える影響を検討することによって、エ クソン3領域における塩基変異が細胞機能に与える影響を明らかにすることを目的とした。まず、マウス肝由来のメタロチオネイン次損細胞中でのこれら変異メタロチオネインの発現を検討したが、その発現量は極端に少なかった。そこで、遺伝子導入効率の良いヒト培養細胞を用いることにした。まず、siRNA法を用いてヒト由来細胞中のメタロチオネイン-II(ヒト細胞中の主要分子種)のノックダウンを試みた。様々な検討の結果、メタロチオネイン-IIの通常発現レベルが低下しているだけでなくカドミウムや亜鉛による誘導も認められないノックダウン細胞を作成することに成功した。本細胞はカドミウムに対して高に感受性を示し、ここに正常なメタロチオネイン遺伝子を導入してもこの感受性は回復しないことから、siRNAが効率良く機能 してメタロチオネインmRNAの分解が生じていると考えられる。また、塩基配列を改変し(アミノ酸配列は正常)、この細胞中に導入してもsiRNAによって認識されないメタロチオネイン-II遺伝子の作成にも成功した。メチル水銀毒性の発現とその調節に関わる細胞内機構の解明Cellular systems involved in development and regulation of toxicity of methylmercury20072011永沼NAGANUMAAkira東北大学・薬学研究科(研究院)・教授久下周佐東北大学・大学院・薬学研究科・准教授基旭東北大学・大学院・薬学研究科・助教高橋東北大学・大学院・薬学研究科・助教トキシコロジーメチル水銀ユビキチン・プロテアソームシステム毒性発現調節脱ユビキチン化酵素放射線・化学物質影響科学基盤研究(S)東北大学2340000021580000215800002158000021580000メチル水銀毒性の発現機構は水俣病の発症から半世紀が経過した現在も不明のままであり,解明のための糸口さえほとんど得られていない。我々は、出芽酵母を用いた研究によって、ユビキチン・プロテアソームシステム(UPシステム)がメチル水銀毒性に対して防御的に機能することを初めて見出した。UPシステムはメチル水銀毒性の増強と軽減に関与する蛋白質の分解に関わっており、これら蛋白質の作用機構と分解機構を明らかにすることによって永年の謎であったメチル水銀毒性発現機構のみならず、UPシステムによるメチル水銀毒性制御機構も解明されるものと期待される。そこで本研究は、UPシステムによって分解が促進されるメチル水銀毒性増強蛋白質およびメチル水銀毒性軽減蛋白質を同定し、それら蛋白質のメチル水銀毒性に対する作用機構を解明すると共に、UPシステムによるそれら蛋白質の分解調節機構を明らかにすることを目的とする。siRNA法による全メタロチオネイン分子種発現抑制細胞の作成20042004永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授久下周佐東北大学・大学院・薬学研究科・助教授siRNAカドミウムヒト由来細胞メタロチオネイン分子種特異的発現遺伝子ノックダウン環境系薬学萌芽研究東北大学3400000ヒト体内に蓄積したカドミウムの大部分は生体防御蛋白質メタロチオネインと結合することによってその毒性発現が抑えられている。ヒトのメタロチオネインには10種以上の構造的に類似する分子種が存在するが、このように多くの分子種が存在する意義は全く分かっていない。この疑問を解くためには、全てのメタロチオネイン分子種を欠損したヒト由来細胞が研究材料として必須である。そこで、本研究では全てのメタロチオネイン分子種の発現が抑制されたヒト培養細胞をsiRNA法を用いて樹立すると共に、本細胞に、siRNAによって認識されないように工夫を凝らしたメタロチオネイン分子種の遺伝子を一つずつ発現させて、それぞれの分子種の機能の比較を可能とすることを目指した。全メタロチオネイン分子種に共通して存在する複数の塩基配列部分をそれぞれ含む種々のsiRNA発現プラスミドを構築し、それらを個々にヒト由来培養細胞に導入し、リアルタイムPCR法によって全メタロチオネイン分子種の発現程度をそれぞれ調べることによって、最も効率良く全てのメタロチオネイン分子種の発現を抑制するsiRNAを選択した。このsiRNA発現プラスミドを用いることによって、恒常的にsiRNAを発現する細胞株を得ることに成功した。この細胞が保持するメタロチオネイン分子種の発現は全て、有意に減少していることが確認され、また、本細胞はカドミウムに対して高い感受性を示した。この細胞中にメタロチオネインIまたはIIを単独で発現させることにも成功し、メタロチオネイン各分子種の作用検討に利用可能な� ��胞株を樹立することができた。酸化ストレスに対する防御機構としてのMVBソーティングシステム20082009永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授MVBソーティングシステムパラコート過酸化水素酵母酸化ストレス防御機構環境系薬学萌芽研究挑戦的萌芽研究東北大学17000001600000本申請者は、酸化ストレス惹起物質であるパラコートの毒性発現に影響を与える酵母遺伝子を網羅的にスクリーニングし、エンドソーム上でのMVB(multivesicular body)ソーティングシステムに関わる5つの蛋白質がパラコートに対して防御的に作用することを見出した。昨年度の検討により、ここで同定された因子以外にも、MVBソーティングシステムに関わる蛋白質(これまでに13種同定されている)はどれを欠損させた酵母も全てパラコートおよび過酸化水素に対して高い感受性を示すことが明らかとなった。一方、MVBソーティングシステムによって認識される蛋白質はいくつかの経路でエンドソームに運ばれるが酸化ストレス防御に関わるのは、エンドサイトーシスやALP経路ではなく、CPY経路を介した輸送系であることが判明した。また、エンドソームから液胞への蛋白質輸送に関わる因子の欠損酵母も酸化ストレスに対して高感受性を示した。これらの結果は、小胞体から液胞への蛋白輸送システムが 酸化ストレス防御に関与していることを示唆している。細胞が酸化ストレスに曝されると蛋白質がカルボニル化されるが、MVBソーティングシステムに関わる因子を欠損させた酵母に酸化ストレスを負荷した際の蛋白質カルボニル化の程度は正常酵母に比べて有意に高く、また、細胞内活性酸素レベルも正常細胞より顕著に高い値を示した。これらのことから、小胞体から液胞へ運ばれることによって細胞内の過酸化レベルを低下させる蛋白質が存在すると考えられる。以上のように、本研究によってMVBソーティングシステムが酸化ストレスに対して防御的に作用していることが明らかとなった。今後、小胞体から液胞へ運ばれる抗酸化蛋白質を同定することによって、酸化ストレスに対する新しい細胞内防御機構が解明できるものと期待さ� ��る。カルシウムによる肝臓メタロチオネインの合成とその意義19861986永沼北里大・薬学部・助教授錦戸典子北里大学・薬学部・助手小山祐子北里大学・薬学部・助手カルシウムマウスメタロチオネインラット初代培養肝細胞生物系薬学一般研究(C)北里大学1700000多くの重要な細胞機能が細胞内カルシウム濃度の可逆的な変動によって調節されていることが明らかにされつつあり、カルシウムの生理作用とその発現機構に多くの研究者の興味が集中している。本研究代表者は最近、カルシウムの投与によりマウス肝臓中にカルシウムを含まず比較的多量の亜鉛を含有する低分子量蛋白質が増加することを見出し、この蛋白質が重金属結合蛋白質として知られるメタロチオネイン(MT)であることを明らかにした。そこで本研究では細胞内カルシウム濃度とMTとの関係について検討した。肝臓中のMT合成を誘導する塩化亜鉛を様々な投与量(0〜150μmol/kg)で、【^(45)Ca】【Cl_2】(175nmol/kg)と共にマウスに投与したところ、12時間後の肝臓中MTおよび亜鉛濃度は亜鉛の投与量に依存して増加し、多く蓄積するようになった亜鉛のほとんどがMTに結合していた。また、この時投与1時間後の肝臓中【^(45)Ca】濃度も亜鉛の投与量に依存した増加を示した。そこで亜鉛とは異なる機構で肝臓中MTを誘導すると考えられるデキサメタゾンを【^(45)Ca】【Cl_2】と共に投与したところ12時間後の肝臓中MTおよび亜鉛濃度の上昇は観察されたが、1時間後の肝臓中【^(45)Ca】濃度の増加は認められなかった。これらの結果から、亜鉛によるMTの合成誘導にCaの細胞内流入が関与している可能性が考えられたのでラット初代培養肝細胞を用いて細胞内カ� �シウム濃度とMTとの関係を検討した。その結果、培地中に亜鉛を添加して22時間培養することによって細胞内MT濃度は有意に増加したが、亜鉛添加2時間後の【^(45)Ca】の細胞内取り込み量は培地亜鉛濃度の影響をほとんど受けなかった。また培地中にカルシウムを比較的高濃度に添加したところ、細胞内カルシウム濃度の増加は観察されたものの、細胞内MT濃度は有意な変動を示さなかった。これらの結果から、カルシウムによるMTの誘導は動物体内でのみ起こる現象と考えられる。生体内防御因子の合成促進による制がん剤の副作用軽減19951995永沼東北大学・薬学部・教授PF1070スクリ-ニングメタロチオネイン制がん剤副作用軽減合成誘導剤重点領域研究東北大学3000000メタロチオネイン(MT)は重金属毒性軽減作用を有する蛋白質として知られているが,我々は,この蛋白質が数種の制がん剤の副作用を顕著に抑制することを明らかにした。そこで,臨床応用可能なMT合成誘導剤を開発することを目的として,MT遺伝子のプロモ-タ-に作用してMT合成を誘導する化合物を検索したところ,数百種類の化合物の中から,微生物培養液柱から単離された新規化合物であるPF1070が強いMTプロモ-タ-活性化作用を有することを見出した。今年度は,本物質のMTプロモ-タ-活性化機構と制がん剤副作用軽減剤としてのヒトへの応用の可能性について検討した。その結果,PF1070は既知のMT合成誘導剤である亜鉛やデキサメタゾンとは異なるプロモ-タ-領域に作用してMTプロモ-タ-を活性化させる全く新しいタイプのMT合成誘導剤である� ��とが明らかになった。PF1070はカドミウム(亜鉛と同様にMTプロモ-タ-上の重金属感応部位(MRE)を活性化する)によって既に充分にMTプロモ-タ-が活性化されているような状態の細胞においてもMT合成誘導作用を示すことから,カドミウムが比較的高濃度に体内に蓄積している一般的な日本人の体内MT濃度も,PF1070のような化合物をMT合成誘導剤として利用することによって効率良く上昇させることが可能であると考えられる。環境汚染物質および放射線に対する生体内防御因子の検索とその応用Screening of Biodefense Factors for Toxicity of Environmental Pollutants or Irradiation19951997永沼NAGANUMAAkira東北大学・薬学部・教授西山省二明治製菓(株)・薬品総合研究所・主席研究員三浦伸彦東北大学・薬学部・助手宮入伸一東北大学・薬学部・助教授西山省ニ明治製菓(株)・薬品総合研究所・主席研究員Biodefense FactorEnvironmental PollutantsIrradiationMethylmercuryResistanceScreeningYeastスクリ-ニングメチル水銀放射線環境汚染物質生体防御遺伝子耐性酵母防御遺伝子環境影響評価(含放射線生物学)試験研究(B)基盤研究(A)東北大学
試験
展開研究
24000001400000環境汚染物質の毒性に対する防御因子として既にいくつかの蛋白質が同定されているが,これら既知の因子よりもさらに強力な作用を有する未知の防御因子が存在する可能性が強く示唆されている。そこで,環境汚染物質の一つとしてメチル水銀を選び,酵母を利用した独創的な方法を用いてメチル水銀毒性に対する防御遺伝子の検索を行った。その結果,メチル水銀耐性遺伝子と思われる完全長ORF(Open Reading Frame)が得られた。この遺伝子を導入した酵母は検討したメチル水銀以外の物質には耐性を示さないことから,今回単離された遺伝子はメチル水銀毒性を特異的に防御する細胞内因子をコ-ドしているものと考えられる。本遺伝子は既知酵素をコ-ドしており,メチル水銀は本酵素の活性を阻害し,また,本酵素の産物を供給することによってメチル水銀の細胞毒性は著しく軽減された。これらの結果から,本研究によって同定されたメチル水銀耐性因子はこれまで全く不明であったメチル水銀毒性の標的分子である可能性が高い。一方,放射線防御因子としての抗酸化酸素の役割をマウスを用いて検討したところ。メタロチオネインが放射線照射による骨髄毒性を顕著に軽減する作用を有することが判明した。メタロチオネイン遺伝子欠損細胞を用い� �検討によってメタロチオネインが他の遺伝子の発現に必須の役割を果たしていることも明らかとなったことから,メタロチオネインが発現を調節している遺伝子の産物が放射線防御作用を示す可能性も考えられる。Some biodefense factors, such as antioxidation enzymes or glutathione, against toxicity of environmental pollutants in cells have been known. However, there is the possibility that other factors more important than these known factors are exist in the cells and tissues. Determination of unknown biodefense factors may be essential to evaluate toxicity of the environmental pollutants.We tried to identify the genes for biodefense factors against toxicity of methylmercury which was selected as a typical environmental pollutant. Yeast clone exhibited resistance to methylmercury was obtained by transfection of plasmid carrying genomic library of yeast. Segregation of the introduced plasmid eliminated methylmercury resistance of the clone, and retransfection of the plasmid isolated from the clone gave methylmercury resistance to the parent yeast. The gene responsible for the methymercury resistance was isolated from the plasmid, and the sequence was examined. Because the protein homologous to the product of this gene has been observed not only in yeast but also in human and other mammals, the gene product may be involved in methylmercury resistance in various species. The gene encodes an enzyme whose activity is inhibited by methylmercury. There is the possibility that the enzyme is a target molecule for methylmercury toxicity.On the other hand, we also studied the mechanism of protective effect of radiodefense drug, bismuth nitrate, against toxic effect of gamma-irradiation. We found that bismuth compounds induce the synthesis of metallothionein in the bone marrow and metallothionein has a role as biodefense factor for toxic effect of gamma-irradiation. We also found that metallothionein regulates expression of other genes in mammalian cells. There is the possibility that protective effect of metallothionein against gamma-irradiation is due to expression of the gene which encodes a defense factor.
環境汚染物質の毒性に対する細胞内標的分子の検索19961996永沼東北大学・薬学部・教授メチル水銀メチル水銀耐性毒性標的分子毒性発現機構神経毒性遺伝子検索酵母環境影響評価(含放射線生物学)萌芽的研究東北大学2200000我が国ではメチル水銀やカドミウムによる環境汚染が原因となって水俣病やイタイイタイ病といった中毒事件が発生したが,未だにその毒性発現機構はほとんど解明されていない。毒性発現機構の解明には毒性の標的となる細胞内因子の同定が「鍵」となるが,これら環境汚染物質の標的分子に関する有用な知見は全く得られていない。そこで本研究では,酵母を用いて,遺伝子ライブラリ-中から環境汚染物質の標的となる分子の検索を試みた。酵母ゲノムライブラリ-を挿入したプラスミドを出芽酵母に導入して,メチル水銀に対して特異的に抵抗性を示す形質変換酵母を検索したところ,無機水銀やカドミウムなどに対する感受性に違いはないもののメチル水銀に対してのみ強い抵抗性を示すクロ-ンを得た。このクロ-ンは遺伝子導入� �よって標的濃度が上昇したために,メチル水銀に対して抵抗性を示す可能性が考えられたので,このクロ-ンからプラスミドを回収して親株に再導入したところ,プラスミドが導入されたほとんどの酵母がメチル水銀に対して抵抗性を示した。このプラスミド中に挿入されている遺伝子断片を単離してその塩基配列を決定した後に,その情報を基に様々な制限酵素を用いて断片化することによって活性部位を検討したところ,メチル水銀の標的分子と思われる蛋白質をコ-ドする遺伝子を同定することができた。この遺伝子の産物はヒトでもその存在が確認されている酵素であり,しかもその酵素活性がメチル水銀によって顕著に阻害されることも判明したことから,この遺伝子産物がメチル水銀毒性の標的分子の一つである可能性が強く示唆された。 本研究によってメチル水銀毒性の標的と考えられる細胞内因子が見つかったが,今後、本知見が突破口となってメチル水銀毒性の発現機構解明に拍車がかかるものと期待される。ヒノキチオ-ルによるメタロチオネインの合成誘導と制癌剤の副作用軽減19971997永沼東北大学・薬学部・教授三浦伸彦東北大学・薬学部・助手カドミウムヒノキチオ-ルメタロチオネイン亜鉛合成誘導遺伝子プロモ-タ-重点領域研究東北大学2600000メタロチオネイン(MT)遺伝子のプロモ-タ-に作用してMT合成を誘導する新しい物質を開発する目的で,MTプロモ-タ-の支配下にβ-ガラクトシダ-ゼを恒常的に発現するL13-17細胞を用いて,約600種類の化合物についてMTプロモ-タ-活性化作用を検討した。その結果,台湾ヒノキの抽出物であるヒノキチオ-ルがL13-17細胞のβ-ガラクトシダ-ゼの活性を著しく上昇させることを見出した。ヒノキチオ-ルのMTプロモ-タ-活性化作用は,これまで知られている最も強力なMT合成誘導剤である塩化亜鉛とほぼ同程度であることから,塩化亜鉛に匹敵するMTプロモ-タ-活性化能を有する薬物であると考えられる。ヒノキチオ-ルをマウスL細胞の培養液に添加した後のMTmRNA量の経時変化をノ-ザンブロット法で解析したところ,ヒノキチオ-ル添加4時間後からMTmRNA量の増� ��が観察され,その後12時間まで増加し続けた。同様の結果はヒト肝がん由来細胞であるHepG2細胞でも認められたことから,ヒノキチオ-ルをリ-ド化合物として臨床応用可能なMT合成誘導剤の開発も期待できる。MTプロモ-タ-上には様々な物質に応答する領域がそれぞれ存在するが,最も強力な応答を示すMREは亜鉛などの重金属により活性化される。そこで低濃度のヒノキチオ-ルと亜鉛またはカドミウムを共存さたところ相乗的にMTプロモ-タ-が活性化されることが判明した。このようにヒノキチオ-ルは金属化合物と併用することによってMTプロモ-タ-を相乗的に活性化することから,体内に比較的多量のカドミウムを含有する一般的な日本人の組織中MT濃度を上昇させる上で有用な可能性が考えられる。シスプラチン耐性に関与するヒト細胞内因子の酵母を用いた検索20002000永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授古地壯光東北大学・大学院・薬学研究科・教務職員
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jp/ja/r/20229644">三浦伸彦東北大学・大学院・薬学研究科・助手Yap1シスプラチン発現抑制耐性遺伝子転写因子酵母特定領域研究(C)東北大学4200000これまでに様々な細胞内因子がシスプラチンに対する耐性獲得因子として同定されてきたが,これらは共に一部のシスプラチン耐性細胞の耐性獲得因子となっていると考えられるものの,臨床上問題となる耐性がん細胞の中にはこれらの因子ではその耐性獲得機構を説明できない例も数多く存在する。我々は,遺伝子スクリーニングにより、酵母に強いシスプラチン耐性を与える機能未知の酵母遺伝子CRP1(HI22)およびCRP2を単離した。今回はCrp1およびCrp2の作用機構について検討した。両蛋白質は共にC末側にロイシンジッパー塩基性領域(bZip)を持ち、その構造上の特徴から転写因子であると考えられたが、GFPとの融合蛋白質強制発現法によりCrp1およびCrp2が共に常に核に局在する蛋白質であることが判明した。酸化的ストレスに応答し、� �アミドや過酸化水素などに対する耐性に関与する酵母転写因子として知られるYap1とCrp1またはCrp2との関係を検討したところ、CRP1またはCRP2遺伝子の高発現によって認められるシスプラチン耐性がYAP1遺伝子の欠損により増強され、さらに、ジアミドにより誘導されるYap1の転写活性がCrp1およびCrp2によって抑制されることが判明した。これらの結果は、Crp1またはCrp2がYap1の転写活性を抑制することによって酵母にシスプラチン耐性を与えている可能性を示唆している。この可能性は、Crp1が示すシスプラチン毒性軽減作用とYap1転写活性抑制作用に必要な最小ドメイン(蛋白質中領域)が一致することからも支持された。以上の結果から、酵母内にはシスプラチン毒性の発現を促進する蛋白質が存在し、Crp1およびCrp2はこの蛋白質の発現を抑制するこ とによってシスプラチンの毒性を軽減するものと考えられる生体内防御因子の合成促進による制がん剤の副作用軽減19941994永沼東北大学・薬学部・教授β-ガラクトシダ-ゼプロモ-タ-メタロチオネイン合成誘導剤転写促進重点領域研究北里大学東北大学3100000メタロチオネイン(MT)の合成を誘導する化合物を検索することを目的として,まず,検索に用いる細胞株を作製した。すなわち,ヒトMTプロモ-タ-の下流にlacZ遺伝子を連結したプラスミドをマウスL細胞にtransfectすることによって,lacZ遺伝子産物であるβ-ガラクトシダ-ゼ(β-Gal)をMTプロモ-タ-の支配下に発現する数種のstable transformantを得た(L/MPZ細胞)。このL/MPZ細胞を用いて,約200種類の化合物についてスクリ-ニングを行ったところ,微生物培養液中から単離された化合物であるNA1301が強いMTプロモ-タ-活性化作用を示すことを見いだした。β-Gal活性の上昇を指標にしてNA1301のMTの合成誘導活性をこれまで知られている最も強力なMT合成誘導剤である亜鉛と比較したところ,NA1301は亜鉛とほぼ同程度のMT合成誘導活性を示した。この効果を細胞毒性を考慮して評価すると,NA1301は細胞毒性を示さない濃度で顕著なMT合成誘導活性(β-Galの上昇)を示したのに対して,亜鉛は細胞毒性とMT合成誘導活性を示す最低濃度がほぼ同程度であったことから,NA1301は亜鉛よりも数段優れたMT合成誘導剤と考えられる。MT合成誘導活性を示すことが知られている亜鉛およびデキサメタゾン(Dex)は� �れぞれMTプロモ-タ-上の異なる塩基配列を認識してMT合成を誘導するが,NA1301をこれら化合物と併用したところ,相乗的なMTプロモ-タ-の活性化が観察された。この結果からNA1301は亜鉛およびDexとは異なる機構でMTプロモ-タ-を活性化する新しいタイプのMT合成誘導剤と考えられる。新しいカドミウム毒性防御機構としてのMVBソーティングシステム201120112011-04-282013-03-31永沼東北大学・薬学研究科(研究院)・教授環境系薬学挑戦的萌芽研究東北大学19500001820000グルタチオンの細胞内代謝に関する研究19901990永沼北里大学・薬学部・助教授HPLCグルタチオングルタチオンエステルシステインマウス細胞内代謝生物系薬学一般研究(C)北里大学1800000グルタチオンはそのままでは細胞内に取り込まれないが,エステル化したグルタチオンは容易に細胞内に取り込まれる。本研究代表者は,グルタチオンの投与ではほとんど軽減されない塩化第二水銀及びシスプラチンの腎毒性がグルタチオンエステルの投与によって効率良く軽減できることをマウスを用いた検討により明かにした。このグルタチオンエステルを用いて細胞内でのグルタチオン代謝を検討するために,まず,HPLCを用いたグルタチオンエステル定量法の確立を試みた。そして,SH基と特異的に反応して蛍光を発するABDーF試薬と試料を中性のpHで反応させたのちにODSカラムで分離することによりシステイン,グルタチオン及びグルタチオンエステルの分別定量が可能なことを明かにした。この方法は簡単でしかも迅速な定量法と して有用と考えられる。グルタチオン及びグルタチオンエステルをマウスに投与して肝臓,腎臓および血漿中のシステイン,グルタチオン及びグルタチオンエステル濃度の経時変化をこの方法で測定したところグルタチオンエステル投与群でのみ肝臓中でのグルタチオン濃度の上昇が観察された。しかし,グルタチオンエステル投与群では肝臓,腎臓および血漿中に未分解のグルタチオンエステルも比較的高濃度に長時間(2〜4時間)存在した。この結果はグルタチオンエステルの生体内での分解が比較的遅いことを示しており,これまでの比較的早いとの知見と異なる。また本研究では,グルタチオンやシステインをマウスに投与した際に肝臓および腎臓中のグルタチオン濃度は増加しなかったがシステイン濃度の有意な上昇が認められた。この事実 は細胞内に取り込まれたシステインのほとんどが速やかにグルタチオン合成に用いられるとのこれまでの考え方を否定するものであり,興味深い知見である。シスプラチン耐性に関与するヒト細胞内因子の酵母を用いた検索19991999永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授古地壯光東北大学・大学院・薬学研究科・教務職員三浦伸彦東北大学・大学院・薬学研究科・助手シスプラチンマイトマイシンC耐性遺伝子転写因子酵母高発現特定領域研究(A)東北大学3200000新しいシスプラチン耐性因子を同定するために,遺伝子ライブラリー中からシスプラチン耐性に関与する遺伝子の同定を試みた。まず,2μm系ハイコピープラスミドYEp13をベクターとする酵母ゲノムDNAライブラリーを酢酸リチウム法により親株(W303B)に導入し,導入遺伝子を高発現する形質転換体(約2.4×104個)を得た。次に,この形質転換体を親株が成育できない濃度のシスプラチンを含む寒天培地で培養し,本条件下で生育してきた酵母クローン中のプラスミドについて解析を行った。その結果,高発現することによって酵母にシスプラチン耐性を与える遺伝子としてCRP1およびCRP2を見いだすことに成功した。両遺伝子は,出芽酵母ゲノム中に存在するORFの中で互いに最も相同性の高い遺伝子であり,これらの遺伝子のコードする蛋白質中には塩 基性領域ロイシンジッパー(bZIP)モチーフが存在する。両遺伝子は,出芽酵母の多剤耐性に関与する転写因子として同定されているYAP1に対しても比較的高い相同性を有することから,CRP1,CRP2およびYAPlを高発現する酵母のシスプラチン以外の薬毒物に対する交叉耐性を調べたところ,CRP1およびCRP2導入酵母はメタンスルホン酸メチルおよびマイトマイシンCに対しても交叉耐性を示したが,YAP1導入酵母が耐性を示す過酸化水素およびカドミウムに対しては耐性を示さなかった。また、YAP1導入酵母はCRPlおよびCRP2導入酵母が耐性を示すシスプラチンおよびマイトマイシンCに対して耐性を示さず,CRPlおよびCRP2が共にYAP1とは異なる機構で薬剤耐性に関与している可能性が示唆された。メタロチオネインの遺伝子多型が引き起こす生育障害20022002永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授久下周佐東北大学・大学院・薬学研究科・助教授カドミウムメタロチオネイン欠損細胞遺伝子多型環境系薬学萌芽研究東北大学3200000我々はカドミウムなどの重金属の毒性を軽減する低分子量蛋白質であるメタロチオネイン(MT)の遺伝子多型を検討し、転写開始地点の上流5塩基目とエクソン3領域の2箇所にその存在を認めている。このうち、エクソン部に塩基変異の認められた4例(119例中)は全てが転写開始地点上流にも変異を有する。両多型の存在率からこの結果は偶然とは考えにくく、エクソン部と転写開始地点上流の両方に塩基変異のある人間は成人まで成長することができるが、エクソン3にのみ変異を有する個体は何らかの理由で成人になる前に死亡してしまうという可能性が考えられる。エクソン3に塩基異常のある遺伝子から作られるMT蛋白質(変異MT)が人間の発生又は生育の段階で好ましくない作用を発揮する可能性も否定できない。そこで本研究は、MT� ��伝子欠損細胞を作製し、この細胞に変異型のMT遺伝子を導入することによって、エクソン3領域における塩基変異が細胞機能に与える影響を検討することを目的とした。まず、MT欠損マウスから肝臓細胞を単離しSV40で不死化することによって培養可能なMT欠損細胞株(MDL細胞)を樹立することに成功した。この細胞にリポフェクション法またはエレクトロポレーション法を用いた変異MT遺伝子の導入を検討したところ、本細胞は遺伝子の導入効率が非常に悪く、遺伝子導入が困難であることが判明した。そこで、組換えアデノウイルスを利用した遺伝子導入を試みた。正常MT遺伝子ORFを含む発現ベクターを構築して導入したところ転写は確認できたものの蛋白質レベルでの発現は認められなかった。一方、染色体MT遺伝子を導入したところ、翻訳� ��正常に行われ、蛋白質レベルでの明らかな発現が認められた。本法を用いて変異MT遺伝子をMT欠損細胞に導入することによって、エクソン3領域における塩基変異の影響が明らかになるものと期待される。gamma-グルタミルシステインの尿中への排泄機構19931993永沼北里大学・薬学部・助教授gamma-GTP欠損症gamma-グルタミルシステインgamma-グルタミルトランスペチダーゼグルタチオン生物系薬学一般研究(C)北里大学2000000グルタチオン(GSH)をシステイニルグリシルとグルタミン酸に分解するgamma-グルタミルトランスペプチダーゼ(gamma-GTP)の欠損症患者の尿中に、GSHとgamma-グルタミルシステイン(gamma-GluCys)が高濃度に排泄されることが報告されているが、正常なヒト尿中にはほとんど排出されないこれらgamma-グルタミル化合物がgamma-GTP阻害時に尿中に比較的高い濃度で排泄される理由は全く解明されていない。そこでマウスを用いて尿中の低分子量SH化合物濃度に対するgamma-GTP阻害剤(acivicin)の影響を検討したところ、ヒトgamma-GTP欠損症の場合と同様に腎臓中のgamma-GTP活性の低下に伴うマウス尿中GSH及びgamma-GluCys濃度の著しい上昇が認められ、この方法でgamma-GTP欠損症病体モデルマウスの作製出来ることが確認された。この時、腎臓及びその他の組織及び胆 汁中にはacivicin投与マウスにおいてもgamma-GluCysは殆ど検出されなかったが、血漿中には正常時でも極微量のgamma-GluCysが検出され、尿と同様にgamma-GTP阻害時にはGSH及びgamma-GluCys濃度の有意な増加が観察された。一方、gamma-GTPの競合阻害剤であるgamma-GluGluを用いて同様の検討を行ったところ尿中のGSH及びgamma-GluCys濃度の上昇は観察されたものの血漿中の両化合物濃度に有意な変化は認められなかった。従つて、gamma-GTP活性低下時に観察される尿中GSH及びgamma-GluCys濃度の増加は必ずしも血漿中濃度の上昇に由来するものではなく、その多くは腎組織中でのSH化合物の代謝系の変動によって説明されるべきものであると考えられる。メタロチオネインを利用した癌化学療法及び放射療法における効果増強19901990井村伸正北里大学・薬学部・教授佐藤雅彦北里大学・薬学部・学振・特別研究員(が田中聡子北里大学・薬学部・助手姫野誠一郎北里大学・薬学部・助手瀬子義幸北里大学・薬学部・講師永沼北里大学・薬学部・助教授メタロチオネイン制癌剤副作用軽減発癌抑制耐性重点領域研究北里大学88000001.メタロチオネインの合成誘導が制癌剤や放射線の副作用軽減に有効なことを既に明らかにしたが,この事実はメタロチオネインを高濃度に含有する癌細胞が制癌剤や放射線に対して耐性を示す可能性のあることを示唆している.そこで担癌マウスを用いて,癌組織中のメタロチオネイン濃度と各種制癌剤の抗腫瘍活性との関係を検討した.その結果,メタロチオネイン合成誘導剤である亜鉛の前投与によってシスプラチン,アドリアマイシン,シクロフォスファミド及びメルファランの抗腫瘍効果が著しく抑制されることが判明した.また別の検討により,担癌マウスに制癌剤を投与することによって癌組織中のメタロチオネイン濃度が有意に増加することも明らかとなった.この結果は,制癌剤の投与そのものによって癌組織が多くの制癌剤� �対して耐性を獲得する可能性を示している.2.癌以外の正常組織中でメタロチオネインの合成を促進させると制癌剤の抗腫瘍活性を損なうことなく副作用のみを選択的に軽減することが出来る.この正常組織でのメタロチオネイン合成誘導が制癌剤による2次発癌の抑制にも有効である可能性がある.そこで制癌剤をマウスに投与した際の腫瘍形成率及び自然発生癌の生成率に対するメタロチオネイン合成誘導剤併用の影響を検討した.その結果,シスプラチン及びメルファランによる肺癌の発生率が亜鉛の前投与によって有意に減少した.また,制癌剤を投与していないマウスに肺癌の自然発生が観察されたが,亜鉛の前投与はこの自然発癌をも完全に抑制した.このことからメタロチオネインは制癌剤など化学物質による発癌を比較的効率が良く抑制すると考えられる.メタロチオネインを利用した癌化学療法及び放射線療法における効果増強19911991井村伸正北里大学・薬学部・教授田中聡子北里大学・薬学部・助手姫野誠一郎北里大学・薬学部・助手瀬子義幸北里大学・薬学部・講師永沼北里大学・薬学部・助教授メタロチオネイン制癌剤副作用軽減発癌抑制耐性重点領域研究北里大学8800000(1)昨年度に引き続きメタロチオネイン(MT)の合成誘導が制癌剤の発癌性に及ぼす影響を観察した.その結果,シスプラチン(CDDP)またはメルファランの投与(投与は最初の2カ月間のみ行いその4か月後の発癌率を測定)により全てのマウス肺に発癌が認められたが,この制癌剤による腫瘍発生率は昨年度の予備検討結果と同様に亜鉛の前投与によって顕著に減少し、さらにビスマスの前投与によって有意な減少が観察された.このときの肺のMT濃度は、合成誘導剤である亜鉛またはビスマスの投与期間中(最初の2か月)は有意に高値を示したが投与中止後は未処理のマウスと有意差は認められなかった.これらの結果から、少なくとも肺のMT濃片が制癌剤投与期間中高く維持されていれば発癌抑制効果が得られると考えられる. (2)MT合成を阻害する薬物を検索した結果、シスタチオナ-ゼ阻害剤であるpropargy1 glycine(PPG)が亜鉛によるMTの誘導合成を阻害することが判明した.担癌マウスに亜鉛を投与して癌組識中のMT濃度を増加させるとこの癌細胞はCDDPに対して強い耐性を示すようになるが、亜鉛投与前に予めPPGを投与しておくことによってこのCDDPに対する耐性が認められなくなった.また、CDDPの用量規制毒性として知られている腎毒性(BUN値の上昇を指標とした)はMT合成誘導剤である亜鉛の前投与によって著しく軽減されたが、PPGはこの亜鉛の示すCDDPの腎毒性軽減効果にはほとんど影響を与えなかった.これは、PPGが亜鉛による腎臓中MTの合成誘導に影響を与えることなく癌組識中MTの合成誘導を抑制するためと考えられる.難治性癌の薬剤抵抗性の分子機構とその克服19921993鶴尾東京大学・分子細胞生物学研究所・教授遊佐敬介(財)癌研究会・癌化学療法センター・研究員八巻東京大学・分子細胞生物学研究所・助手内藤幹彦東京大学・分子細胞生物学研究所・助手中島元夫東京大学・分子細胞生物学研究所・助教授永沼北里大学・薬学部・公衆衛生学教室・助教授冨田章弘東京大学・分子細胞生物学研究所・助手P-糖タンパクアポトーシスカルシウム拮抗剤モノクローナル抗体ユビキチン分子標的抗癌剤耐性癌転移耐性タンパク耐性克服耐性遺伝子重点領域研究東京大学2500000030000000難治性癌の分子機構、難治性癌の診断法と治療法、抗癌剤の新しいターゲット、転移性癌細胞の特性の解明とその制御、などについて研究を行なった。これらの研究に対し、以下の主要な成果を得た。1.難治性癌の分子機構の解明:P-糖蛋白質のエピトープを解析することにより、P-糖蛋白質の三次構造の情報が得られた。耐性細胞において発現している85kDa蛋白質のcDNAのクローニングと塩基配列決定により、85kDa蛋白質は接着因子CD36と同一であることが明らかになった。耐性への関与は未知である。2.難治性癌の診断法と治療法の研究:P-糖蛋白質の抗体MRK16はサイクロスポリンの細胞外排出を阻害することにより、その耐性克服作用を増強することが明らかとなった。またM-CSFが存在すると抗体による細胞障害作用が強くなり、M-CSF遺伝子を耐性細胞に導入することにより、抗体によって有効な耐性細胞の排除が可能になった。サイトカイン遺伝子による耐性の遺伝子治療に道を拓くものである。3.抗癌剤の新しいターゲットの解明:マイトマイシンの耐性機構として、耐性細胞では2電子還元に働くDT-diaphoraseが欠損していることが明らかとなった。新規抗癌剤KW2149はマイトマイシン耐性細胞に有効性を示すが、そのメカニズムは未知である。メタロチオネインが多剤耐性付与因子であることが明らかとなった。また細胞のアポトーシス(細胞死)阻止に働く168と23kDaの膜因子が同定された。4.転移性癌細胞の特性とその制御:癌の転移にタイプIVコラゲナーゼを含むメタロプロテナーゼが関与していることが明らかとなった。またリンパ節転移の成立には上述のアポトーシスを阻止する168、23kDaの膜因子が関与していることが示された。メタロチオネインを利用した癌化学療法及び放射線療法における効果増強19921992井村伸正北里大学・薬学部・教授香川聡子田中聡子北里大学・薬学部・助手姫野誠一郎北里大学・薬学部・助手瀬子義幸北里大学・薬学部・講師
どのように生まれたばかりの豚の遺伝的異常は解消することができる
jp/ja/r/80155952">永沼北里大学・薬学部・助教授HeLa細胞シスプラチンプロパルジルグリシンメタロチオネイン耐性克服耐性因子重点領域研究北里大学7000000制癌剤耐性因子としてのメタロチオネイン(MT)の意義を検討するために,HeLa-S3細胞にマウスMT-IのcDNAを導入することにより樹立したMT-Iを多量かつ安定に発現するクローンを用いて以下の実験を行った。このクローンをヌードマウスに皮下移植して細胞内MT濃度とシスプラチンに対する感受性との関係を検討したところ,皮下移植した本クローン中のMT濃度は対照として用いたベクターのみを導入したHeLa細胞に比して約3.5倍高いMT濃度に示し,しかもシスプラチンに対して著しい耐性を示した。この結果は,細胞内MT濃度の上昇が癌細胞のシスプラチンに対する耐性獲得に関与することを強く示唆している.我々は昨年度,亜鉛による癌組織中MTの誘導合成をpropargylglycine(PPG)が抑制することを見いだしたので,このクローンを皮下移植したヌード� ��ウスを用いてPPGの効果を検討した.その結果,クローン中のメタロチオネイン濃度はPPGの投与によって有意の減少し,しかもこのクローンのシスプラチンに対する抵抗性も顕著に低下した。即ち,PPGは誘導剤投与による組織中MT濃度の上昇を抑制するのみならず,腫瘍細胞の種類によってはそこで恒常的に発現しているMTのレベルを低下させる効果も有することが明らかになった。抗酸化因子としての必須微量元素セレンの役割に関する研究Role of Selenium in Protection against Oxidative Stress19931995井村伸正IMURANobumasa北里大学・薬学部・教授YimingXiaChinese Acad. Prerent・Med. Dept. of Trace E・Head of DeRaymondFVanderbilt University・Dept. Mediane・教授瀬子義幸北里大学・薬学部・講師永沼北里大学・薬学部・助教授姫野誠一郎北里大学・薬学部・講師豊田春香東京大学・医科学研究所・講師XiaYiming中国予防医学科学院・栄養食品衛生研究所・室長BurkRaymondVanderbilt大学・医学部・教授oxidative stressradical scavengerseleniumselenoproteinsspecies differencetransformantsセレンセレン蛋白質ラジカルスカベンジャ-動物種差過酸化ストレス遺伝子導入細胞国際学術研究北里大学
共同研究
250000025000002000000必須微量元素セレンは、過酸化物を除去する酵素グルタチオンペルオキシダ-ゼの活性中心を構成することから、生体内で活性酸素障害防御因子として機能しているものと考えられている。しかし、近年、GSH-Px以外にもセレンを含む蛋白質が存在し、生体内で重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。GSH-Px以外の代表的なセレン蛋白質として、血漿中のセレンの60%以上を結合しているselenoprotein Pがある。本共同研究の米国側分担研究者であるBirkは、selenoprotein Pの存在を世界で最初に見い出し、その性状を明らかにしてきた。最近、当該蛋白質に精製、遺伝子のクロ-ニングに成功し、セレノシステインをコ-ドする(本来、終止コドンである)UGA codonがopen reading frame中に10個存在する極めて特殊な蛋白質であることを発見している。しかし、この蛋白質の機能は、radical scavengerである可能性が示唆されているものの、いまだに不明である。selenoprotein Pの機能を明らかにするためにも、蛋白質の構造解析が急務となっていた。本研究において、日本側と米国側が互いに共同して研究を行うことにより、selenoprotein Pがヘパリンに親和性を持ち、その親和性がpHに依存して変化すること、ヘパリンとの親和性の差、及び分子量の違いから、selenoprotein Pをいくつかのisoformに分離できること、1つのisoformは、C-末端が2番目のUGA codonの直前であること、すなわち、2番目のUGA codonの一部は終止コドンとして働いている可能性を示した。これらの成果は、米国FASEB meetingで発表するとともに、Arch.Biochem.Biophys.に発表、およびJ.Biol.Chem.に投稿した。日本側は、セレンの生理作用のみならず、セレンによる活性酸素発生の機構についても研究を行ってきた。一方、米国側Burkは過酸化障害の鋭敏な指標として注目されているF2-isoprostanesをセレン欠乏動物のおける過酸化障害の指標として活用している。本共同研究によって、日本側研究者を米国に派遣することにより、GC-MSを用いたF2-isoprostanesの測定技術を直接習得することができたことは今後の研究の展開の上で非常に意義深い。中国には、土壌中のセレン濃度が著しく低い地域が存在し、そこで多発していた心臓疾患とセレン欠乏との関連が注目されている。本研究の当初の目的の1つとして、中国のセレン欠乏地域での調査研究を企画していたが、中国側のセレン補給活動が功を奏して、現在では、セレン欠乏症状はほとんど観察されなくなっていることが、中国側との情報交換で明らかになった。一方、中国には土壌中セレン濃度が逆に著しく高いために、セレン中毒症が発生している地域がある。そこで、湖北省恩施市周辺のセレン中毒症発生地域を訪問、調査した。その結果、摂取するセレンの化学形の違いにより、現われる中毒症状の程度が異なっている可能性が見い出された。現在、セレンの化学形別の分別定量方法を日本と中国とで共同して� �発中である。本共同研究において、日米間の共同研究では、selenoprotein Pのisoformの発見とそのcharacterizationという具体的な成果をいくつか出すことができた。しかし、日中間においては、今後の共同研究の準備が整ったという段階に達しただけであることは否めない。しかし、セレンの生理作用のみならず、セレンの毒性発現機構についても活性酸素の関与を追及してきた日本側が、実際の人間の病気としてセレン欠乏症と中毒症の両方を持つ中国側と共同研究を行う基盤を持つことができたことは、今回の共同研究の大きな成果であったと評価できる。また、セレンの生理活性を遺伝子レベルで解析するための研究基盤造りを行っている中国側に対し、日本側、および米国側から本共同研究を通して多くの技術供与、プロ-ブの提供などを行うことができた。Selenium, an essential trace element, is considered to act as an antioxidant in animal body since it constitutes the active site of glutathione peroxidase (GSH-Px). Recently, several selenoproteins other than GSH-Px were identified. Selenoprotein P is a newly recognized selenoprotein that contains about 60% of selenium in the plasma.In this international collaboration study, US and Japanese researchers worked together to characterize selenoprotein P using techniques of protein chemistry. Several isoforms of selenoprotein P purified from rat plasma were identified and characterized. All the isoforms were able to be bound to a heparin Sepharose column, but the elution pattern by pH gradient was different among these isoforms. This suggested that each isoform of selenoprotein P may have a different binding affinity to proteoglycans located outside the plasma membrane surrounding the blood vessels. Furthermore, we isolated one of the isoform and determined its C-terminal amino acid sequence. This isoform was truncated at the site just upstream of the second UGA codon, suggesting an alternative usage of the second in-frame UGA codon for selenocysteine insertion and termination of the translation.In China, human diseases of both selenium deficiency and selenium intoxication were observed. A Japanese researcher visited the area of selenium poisoning for the first time by this grant. A difference in health effect of selenium was recognized between two villages of this area, probably due to the difference in the chemical form of selenium ingested by villagers. Japanese and Chinese sides are now working together for the development of analytical method of selective determination of organic and inorganic selenium.To assist Chinese researchers for the establishment of a laboratory for molecular biological studies on the mechanism of selenosis and selenium deficiency-related diseases, both Japanese and US researchers provided technical assistance and various kinds of cDNA probes.
メタロチオネインの生理機能の分子レベルでの解析と臨床応用に関する研究Physiological and Clinical Implication of Metallothionein19961997井村伸正IMURANobumasa北里大学・薬学部・教授JohnS.ピッツバーグ大学・医学部・教授近藤幸尋日本医科大学・医学部・講師永沼東北大学・薬学部・教授姫野誠一郎北里大学・薬学部・助教授LazoJohnピッツバーグ大学・医学部・教授Anticancer drugApoptosisCarcinogenesisHeavy metalKnockout mouseMetallothioneinアポト-シスノックアウトマウスメタロチオネイン制癌剤発癌重金属生物系薬学国際学術研究北里大学
共同研究
250000025000001.米国側においてMTKOマウスの胎仔由来初代培養細胞にSV40を感染させることにより不死化した細胞株を得た。日本側でこの細胞の諸特性について明らかにした。SV40で不死化したMT欠損細胞株はMT遺伝子を含有する細胞に比べてシスプラチンによるアポト-シスが起こりやすくなっていた。初代培養細胞の場合とは異なり、この差をp53レベルでは説明できなかったが、c-myc遺伝子の関与を示唆するデ-タを得ることができた。このMT欠損不死化細胞からさらにシスプラチンおよび、Cd耐性細胞を確立した。シスプラチン耐性細胞株すべてにおいて、チオレドキシンや核内でのレドックス制御とDNA修復酵素活性を持つRedox Factor-1(Ref-1)レベルが上昇していた。一方、MT欠損Cd耐性細胞は、Cdの取込が親株細胞に比べて約10%と非常に低い値を示した。これらの細胞株を用いることにより、MT以外の新たなシスプラチン耐性因子、Cd耐性因子、を見いだすことが可能になった。2.日本側において、メタロチオネイン遺伝子欠損マウス(MTKOマウス)、及びその対照となる129SVマウスに、膀胱癌を誘発するN-butyl-N-4-hydroxybutyl nitrosamine(BBN)を飲水から2カ月間摂取させ、MT遺伝子の有無が癌発生率に影響を与えるかどうか検討した。その結果、癌発生率は129/SVマウスで42.9%であったのに対し、MTKOマウスでは72.9%と1.7倍高かった。また、129/SVマウスではBBN投与期間中に亜鉛を連続投与することにより、癌発生率が20%まで減少したが、MTKOマウスでは癌発生率が変化しなかった。従って、BBNによる化学発癌に対し、メタロチオネインが抑制的に働くことが明らかになった。1. To examine the protective role of physiological concentration of metallothionein (MT) against chemical carcinogenesis, MT-I and -II null (MTKO) and control (129/SV) mice were given N-butyl-N-4-hydroxybutyl nitrosamine (BBN) and the formation of bladder tumors were examined. The incidence of bladder tumor in MTKO mice was 72.9%, whereas 42.9% in 129/SV mice. Zn administration reduced the tumor incidence only in 129/SV mice. These data suggested that the baseline level of MT has protective role against chemical carcinogenesis.2. SV40-transformed fibloblasts were obtained from both MTKO and 129/SV embryonic primary cultured cells. We established cisplatin-resistant and Cd-resistant MT null cells by gradual escalation of chemicals in the medium. Cisplatin-resistant MT null cells showed cross-resistance to Melphalan, paraquat and other ROI inducing agents. The cellular levels of thioredoxin and Ref-1, the latter molecule confers not only the redox regulation in the nucleus but blso the DNA repair by its endonuclease activity, were increased in cisplatin-resistant MT null cells. The accumulation of cisplatin as determined by Pt incorporation into the cells was lower in cisplatin-resistant MT null cells. Cd-resistant MT null cells also showed decreased accumulation of Cd compared to the parental MT null cells. The results of this study enabled further clarification of factors involved in cisplatin or Cd resistance other than MT.
紫外線障害に対する皮膚の防御機構:メタロチオネイン・ノックアウトマウスの光感受性19971999花田勝美弘前大・医学部・助教授永沼東北大学・薬学部・教授澤村大輔弘前大学・医学部・附属病院・講師アポト-シスサンバ-ン細胞ノックアウトマウスメタロチオネイン増殖皮膚紫外線皮膚科学基盤研究(C)弘前大学
一般
800000500000600000前年度は、種を越えて細胞内に存在するメタロチオネイン(MT)蛋白の紫外線障害抑制効果を検討するため、MTノックアウトマウス皮膚を用いて、中波長紫外線UVA誘導障害細胞の発現を観察した。その結果、MTノックアウトマウスにおいては、サンバーン細胞、アポトーシス細胞のいずれもが対照に比較して増加した。この事実は、従来のMT誘導皮膚の紫外線抵抗性を裏付けるとともに、サンプロテクションにおけるMTの有用性を改めて示した。MT欠乏マウスの紫外線感受性の増加が、MTの抗酸化能のみに依存しているのか否かを検討するために、MTノックアウトマウスを用いて、表皮の増殖に及ぼす影響を検討した。[方法]MTノックアウトマウス背部皮膚に表皮の増殖をもたらすcholera toxin,TPAの局注および中波長紫外線UVBの照射を行い、対照マウスのそれと比較検討した。[結果]MTノックアウトマウス背部表皮はいずれのマウスでも著明な増殖をみたが、MTノックアウトマウスの増殖は対照に比較して抑制されていた。MTの存在は表皮の増殖に関与し、長期の紫外線曝露にあっては紫外線抵抗性が低下することが示唆された。これらの結果は、Jounal of Investigstive Dermatology 111巻(1998)の2篇に報告した。今後は創傷治癒におけるMTの関与と存在意義を検討する予定である。
新しい重金属耐性因子の検索及び同定19971997三浦伸彦東北大学・薬学部・助手永沼東北大学・薬学部・教授カドミウムカドミウム耐性細胞ディファレンシャルディスプレイノックアウトマウスメタロチオネイン耐性因子公衆衛生学・健康科学萌芽的研究東北大学1900000カドミウム(Cd)に対する耐性因子としてメタロチオネイン(MT)が知られているが、MTだけではその耐性獲得機構を説明できないようなCd耐性細胞の例もいくつか存在し、また遺伝子操作により細胞内MTレベルを上昇させてもCdに対して耐性が認められないとの報告もあることから、MT以外の重金属耐性因子の存在が予想される。そこで本研究ではMT遺伝子欠損マウスの肝臓から樹立した不死化細胞(KO-cell)よりCd耐性細胞を単離し、この細胞にCd耐性を与えている因子の検索・同定を試みた。その結果、まずKO-cellに90%致死量の塩化カドミウムを添加して生き残って増えてきた細胞を得、この操作を3回繰り返すことによってCdに耐性を示す細胞集団(KO-Cd cell)を単離することに成功した。本細胞は親株であるKO-cellに比べてCdに対して約2倍の耐性を示すと共に、無機水銀に対しても耐性を示したが亜鉛に対しては殆ど耐性を示さなかった。KO-Cd cellはMT遺伝子を欠損しているため、この耐性細胞はMT以外の細胞内因子の量的(或いは質的)変化により耐性を獲得した可能性が高い。そこで次にKO-cellとKO-Cd cellとの間で発現量の異なる遺伝子をDifferential Display法を用いて検索した。その結果、KO-Cd cellで再現性良く高発現している5種のPCR産物を確認することができた。現在これらPCR産物の塩基配列解析を行っているが、今後その情報を基にしてcDNAを単離し、Cd耐性との関連を調べていく予定である。メタロチオネイン遺伝子異常とその診断法の開発Polymorphism in the promoter and coding regions of human metallothionein IIA gene19981999吉田YOSHIDAMinoru聖マリアンナ医科大学・医学部・助教授井出株式会社 クマモト抗体研究所・代表取締役永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授山崎健太郎聖マリアンナ医科大学・医学部・助教授中田幸之介聖マリアンナ医科大学・医学部・教授CadmiumKidneyMtallothioneinPolymorphismPromoterRenal injuryカドミウムプロモーター異常メタロチオネイン腎臓腎障害遺伝子異常環境影響評価(含放射線生物学)基盤研究(B)聖マリアンナ医科大学
展開研究
67000006300000体内に取り込まれたカドミウムはほとんど排泄されることなく残留し続けるため人間体内のカドミウム濃度は加齢と共に増加する。カドミウムは穀類中に比較的高濃度に存在することから,米類を多食する日本人は欧米人に比べると組織中カドミウム濃度が高い。日本人の腎臓中に蓄積しているカドミウムはそのほとんどが重金属毒性軽減蛋白質メタロチオネインに結合した"低毒性"の形で存在しており,一般成人の腎臓中に蓄積しているカドミウムの濃度はメタロチオネイン遺伝子を欠損させたマウスを死に至らす濃度の数倍にものぼる。しかし最近,比較的高齢にも関わらず腎臓中のメタロチオネイン濃度が極端に低い日本人が存在することが明らかとなった。そこで,法医解剖された55例について平成10年度に腎臓中カドミウム濃� �を測定したところ,低いメタロチオネイン濃度を示す個体の存在が確認された。この低メタロチオネイン症が生じる原因として遺伝子の異常が考えられることから,平成11年度には日本人の腎組織中でのメタロチオネイン遺伝子およびそのプロモーター領域における塩基配列異常の有無を一本鎖DNA高次構造多形検出法(PCR-SSCP)により検出した。法医解剖検体の腎皮質(21例)よりgenomicDNA抽出してSSCP法およびdirect sequencing解析によりヒトMT-IIA遺伝子の変異を検討したところ,プロモーター部に一塩基置換のあるものが4例,エクソン3に一塩基置換があるものが2例確認された。プロモーター部の変異は4例とも転写開始点から5′側上流の5塩基目に認められ,全例がA→Gの置換であった。一方,エクソン3の変異は2例とも同位置のGCC→GTC置換であり,Ala→Valの1アミノ酸変異をもたらすものであった。また,これらのうちの1例は同一アレルプロモーターとエクソン3の両方に置換が認められた。今後はこれらの塩基置換がメタロチオネイン蛋白質の合成に与える影響について検討する必要があろう。Cadmium concentration in the human tissues increase with aging because most of the accumulated cadmium may be remained in the bodies without excreting. General Japanese usually well eat rice which naturally containing relatively high concentration of cadmium. On the other hand, cadmium has been known to induce synthesis of metallothionein, a mental binding protein which reduces toxicity of heavy metals. In the general adults, most of cadmium accumulated in the tissues exist as low toxic complex with matallothionein. We found some Japanese adults whose kidneys have relatively low concentration of metallothionein. There is a possibility that the "low metallothionein" may be induced by genetic disorder. Therefore, we examined abnormality of nucleotide sequence of metallothionein gene and its promoter region of general Japanese by single-stranded conformation polymorphism method(PCR-SSCP). Genomic DNA samples were extracted from cortex of kidney of the forensic autopsy samples(21 examples). By PCR-SSCP and direct sequencing methods, abnormalities of nucleotide sequence of metallothionein gene and its promoter region were observed in some samples. Single base substitutions were found in the promoter region of four samples and in the exon 3 of two samples. The substitution(A->G) in the promoter region in all four samples was observed in 5 bases upstream from the transcription starting point. On the other hand, the mutation(GCC->GTC) of exon 3 was observed in the same site of the two samples, inducing the amino acid substitution of Ala->Val. In one sample, these two substitutions was observed in identical allele of promoter and exon 3. Effect of these base substitutions on the synthesis of metallothionein will be examined in future.
日本の内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)研究のネットワーク作りNetwork of Endocrine Disruptor Research in Japan19981998井口泰泉IGUCHITaisen横浜市立大学・理学部・教授長山淳哉九州大学・医療短期大学部・助教授永沼東北大学・薬学部・教授彰彦北海道大学・水産学部・教授田辺信介愛媛大学・農学部・教授
jp/ja/r/50183752">梅園和彦京都大学・ウイルス研究所・教授Developmental abnormalitiesEndocrine distuptorsEnvironmental hormonesReproductive abnormalitiesSewage treatmentWildlife下水処理内分泌撹乱化学物質内分泌攪乱化学物質環境ホルモン生殖異常発生異常野生動物基盤研究(C)横浜市立大学
一般
環境中に放出された農薬、プラスチックの原材料、界面活性剤など、多くの化学物質(内分泌撹乱化学物質)が体内のエストロジェンと類似の作用を示し、鳥類、爬虫類、魚類などの野生動物種の性器異常、発生異常、個体数の減少、ヒトの乳癌、子宮内膜症、精巣癌の増加、精子数の減少を誘起している可能性が示唆されている。内分泌撹乱化学物質の環境中での存在量を調べ、動物及びヒトへの影響の把握とともに早急に対応を検討する必要がある。この研究は、ヒトを含めた動物の生殖・行動異常等の実体把握や内分泌撹乱化学物質の発生・生殖異常への関与を、学際的な協力体制のもとに解析することを目的としている。このため、この問題に対する研究者の関心を高めるとともに、社会へのアピールを行うため横浜で公開� ��ンポジウムを開催した。動物学(井口、守、和田)の分野での、発生・生殖に対する内分泌撹乱化学物質の作用、水産学(原)分野で河川・海洋系でのビテロジェニンの利用、薬学(永沼)分野での環境残留物質の生態影響、農学・環境学(田辺、眞鍋)分野での海棲哺乳動物への影響把握、医学(森、長山)の分野で、胎児に対しての研究を円滑に行う体制作り、内分泌撹乱化学物質の作用機構(梅薗、佐藤)を分子生物学的に検討するネットワーク作り、下水処理過程でのホルモン様作用を調査するとともに、環境工学分野(松井)のネットワーク作りを行った。これらの研究によって得られた成果をまとめ、将来的な足がかりとする。このような学際的な研究体制は極めて希であるが、今後の環境問題の研究には、化学物質の製造、使用、環境放出、生 物影響、汚染の阻止を一貫して考えるための学際的な協力が不可欠であり、そのモデルケースとなる。Numerous chemicals, pesticides, materials for plastics and detergents having estrogenic activity, have been released into the environment. These chemicals have potential to disrupt the development and function of the endocrine system in wildlife and humans, being called as endocrine disruptors (EDs). There is a hypothesis that EDs may related to decrease in population of wildlife, increase in breast cancer, endometriosis, testicular cancer and decrease in sperm count in humans, since these chemicals may bind to estrogen receptors and thus evoke estrogenic effects in animals and humans. We need to know the levels of EDs in the environment and potential effects on wildlife and humans. The present research was aimed at making a research group studying EDs in various aspects and recruit researchers from various research fields to share common interests. We organized public symposium on EDs in Yokohama. In zoology, Iguchi, Mori and Wada made a research groups to study effects of EDs on development and reproduction on animals. In fisheries, Hara made a research group to study usefulness of vitellogenin in monitoring of fish in river and sea. In pharmacology, Naganuma made a group to study the ecological effect of persistent pollutants. In agriculture and environmental science, Tanabe and Manabe made a group to study EDs effects on marine mammals and malformations. In medicine, Mori and Nagayama made a group to study EDs effects on fetus and human reproduction. Umesono and Sato studied made a group to study action mechanism of EDs. In technology, Matsui made group to study sewage treatment. Each research group is unique and these research groups work hard to solve endocrine disruptor issue and suggest how to control chemical release in the environment and reduce adverse effects on wildlife and humans by EDs.環境に応答する亜鉛の活性酸素による細胞死制御機能の解析MODIFICATION OF REACTIVE OXYGEN SPECIES-INDUCED CELL DEATH BY THE INCREASED ZINC IN RESPONSE TO STRESS19982000佐藤政男SATOMasao徳島文理大学・薬学部・教授永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授APOPTOSISMETALLOTHIONEINMITOCHONDRIAOXIDATIVE STRESSTUMOR NECROSIS FACTORZINCアポトーシスシトコンドリアチトクロームCミトコンドリアメタロチオネイン亜鉛腫瘍壊死因子酸化的ストレス環境系薬学基盤研究(C)福島県立医科大学徳島文理大学
一般
1300000800000600000ストレスに応答し亜鉛が肝臓に蓄積する。亜鉛は必須金属で様々な生体応答の調節を行うが、蛋白質のSH基等と反応して構造変化を引き起こし障害も惹起する。従来亜鉛は毒性が低く細胞障害抑制性が強調されてきた。それは細胞や組織への亜鉛負荷はメタロチオネイン(MT)を誘導し亜鉛結合体となるためMTの細胞障害抑制作用に焦点が当てられ、亜鉛自体の機能解析が困難だった為である。亜鉛がアポトーシスを抑制し、その作用部位としてcaspase-3活性阻害である事が提唱されている一方で、脳虚血の際に過剰の亜鉛が遊離され神経細胞を障害することが報告され、亜鉛の生理的意義は細胞に対する保護作用と障害作用の両面からの解析が必要である。本研究では、MT欠損細胞等数種細胞を用い亜鉛代謝を変動させ、亜鉛と拮抗し活性酸素産生するCdを用いアポトーシス系を構築し、ミトコンドリアを介する事を示した。同時に亜鉛は用いた細胞の障害を惹起しなかった。そこで細胞内亜鉛濃度増加時の亜鉛及び腫瘍壊死因子存在下の作用を解析した。一過性細胞内亜鉛濃度の亢進した時の生体の細胞の生存がどのように変化するかを亜鉛イオノフォアー(ピリチオン)を用いて検討すると、HL-60細胞と繊維芽細胞共にある一定濃度でのみDNA断片化が観察された。より高濃度では断片化はみられなかったが、細胞生存率減少がおこる事からアポトーシスではなく壊死による細胞死と考えられる。細胞内亜鉛濃度により細胞死経路が規定されると考えられた。更に亜鉛依存的なアポトーシス誘導は未知経路の可能性が示唆され、今後検討の必要がある。活性酸素を産生して多彩な作用を示す腫瘍壊死因子はMT欠損マウス細胞より正常細胞で生存率が低下した。この細胞毒性発現に伴うMTの毒性増強作用はIkB-α、p38MAPK等に依らない事が示され、さらに情報伝達系におけるMTの作用の検討が必� ��である。Zinc is essential for the survival of the cells, and is required for the functions of many enzymes and zinc-finger proteins etc., and is known to be protective role against cell damage. Zinc accumulates in tissues in response to various kinds of stresses. Recently, it has been shown that excessively released zinc may selective neuronal death after transient global is chemia by accumulati on of chelatable zinc in vulnerable neurons. On the other hand, depletion of intracellular zinc induces neuronal apoptosis, and zinc is known to be anti-apoptotic metal. The studies are required for both protective and toxic actions for the survival of the cells.Treatment of HL-60 cells with pyrithione, zinc ionophore, increased the zinc content, and co- existence of zinc and pyrithione in the cell culture medium further increased the zinc content in the cells, and showed DNA fragmentation, one of the hallmarks of apoptosis. The fragmentation was observed only at the certain concentration of zinc in the presence of pyrithione. At the higher concentration of zinc, it was not observed, whereas the viability of the HL-60 cells was significantly decreased, suggesting that mode of the cell death is necrosis. Similar results were obtained in fibloblast cells. Data indicate that the concentration of Zn within cells determines mode of zinc-induce cell death.Tumor necrosis factor (TNF) acts via oxygen radical species. Co-existence of zinc and TNF accelerates cell death. TNF decreased viabilitv of normal (metallothionein, MT +/+) Ito cells, whereas MT(-/-) Ito cells were not affected. The data suggest that metallothionein modifies cell death-induced by TNF.TNF did not affect IkB- α, p38 MAPK etc. Further studies are required to establish the role of MT in TNF-induced cell death.
一酸化窒素による金属結合蛋白質ニトロソ化とその金属代謝に与える影響Effects of the s-nitrosylation of metal-binding proteins bu nitric oxides on the metabolism of metals19992001仲井邦彦NAKAIKunihiko東北大学・大学院・医学系研究科・助教授亀尾聡美東北大学・大学院・医学系研究科・助手永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授佐藤東北大学・大学院・医学系研究科・教授EndotoxinGlutamateMetal metabolismMetal-binding proteinsMetallothioneinMethylmercuryNitric OxidesS-nitrosylationS-ニシロソ化S-ニトロソ化s-ニトロソ化エンドトキシングルタミン酸ノックアウトマウスメタラチオネインメタロチオネインメチル水銀一酸化窒素金属代謝金属結合蛋白質衛生学基盤研究(B)東北大学
一般
790000039000002000000一酸化窒素(NO)およびそのS-ニトロソ体代謝物が脳内微量金属元素代謝と脳の機能に及ぼす影響を明らかにするために、NO過剰産生条件を作出し、脳内細胞外液Nox量と遊離微量元素の動態を解析した。具体的には、マウス(C57BL/6Cr)海馬CA3領域にマイクロダイアリシスを施し、その後にエンドトキシン100-1000μg/kgを腹腔投与し、マイクロダイアリシス灌流液に回収された細胞外液中のNoxをHPLCを利用したGriese法により、また微量金属元素である亜鉛と銅の濃度をプラズマイオン源質量分析装置(ICP-MS)により定量した。その結果、エンドトキシン1000μg/kgではNoxに加え、亜鉛と銅の濃度上昇が観察された。興味ある点はNoxは一過性の上昇であるにもかかわらず、微量金属濃度の増加は持続性であり、3時間ほど継続する現象であった。< paragraph sequence="2">次に、メチル水銀曝露モデルにて、1)メチル水銀曝露に伴うマウスの情動、空間学習に関する神経行動学的な評価を実施しつつ、さらに2)その際の脳内海馬CA3領域のグルタミン酸代謝の変動を同じくマイクロダイアリシスにより解析した。その結果、情動ストレスの亢進に相関して、グルタミン酸濃度の絶対値に差は見られないものの、カリウム100mMによって動員されるグルタミン酸量が低下した。グルタミン酸代謝ではNOが受容体活性制御に関しており、グルタミン酸動員にかかわるNOと金属元素の関与が示唆される。しかしながら、このメチル水銀曝露モデルにおいてNOと金属元素のクロストークを上記と同様な方法で検討したが、有意な結果は得られなかった。この点は分析方法や検出感度に工夫を加え追試による確認が必要と 考えられた。微量金属元素は、細胞内外で原則的に遊離型ではなくSHに適合した結合型として存在している。NOはそのSHを攻撃し金属元素を遊離せしめる。このメカニズムとその生物学的意義はまだ未解明であるが、本研究によってNOにより一部の元素で自由度が増加しマイクロダイアリシスで検出可能な形に移行することが示され、今後の研究が期待された。The influence of nitric oxides and its s-nitrosylated metabolites on the metabolism of metal and essential elements had been examined in mice. In the first experiment, the mice were treated with endotoxin (100-1000 ug/kg, i.p.) and then the NOx and metal concentrations in the perfusate of the hippocampus C3A region obtained with the microdialisys were determined using HPLC (for Nox) and ICP-MS (for zinc and cupper). The results showed that the treatment with endotoxin significanytly increased in the concentrations of both NOx and zinc in the perfusates. These results suggest that the overproduction of NO in the brain might mobilized the intracellular zinc. In the second experiment, the mice were exposed prenataly to methylmercury to make the animal model to examine the functional roles of nitric oxides in the neurodevelopment. Methylmercury is known to induce the NO synthase. The association of the neu robehavioral changes with the metabolism of glutamate in the hippocampus CA3 region was examined. Although the treatment with methylmercury did not increase the extracellular glutamate concentration, the mobilization of glutamate was significantly inhibited. There were also some data showing the disturbance in the concentrations of some metal components in the brain after the methylmercury treatment. However, no direct evidence indicating the positive association between methylmercury-induced NO production and the alternation of metal metabolism. Further studies regarding the biological relationship between NO generation and the metal mobilization is required to understand the biological roles of metals and the metal-binding proteins.
メタロチオネイン濃度の個体差の原因解明とその診断法の開発Mechanism of Individual Difference in Metallothionein Concentration in the Kidney19992000宮入伸一MIYAIRIShinichi東北大学・大学院・薬学研究科・助教授古地壯光東北大学・大学院・薬学研究科・教務職員三浦伸彦東北大学・大学院・薬学研究科・助手永沼東北大学・大学院・薬学研究科・教授CadmiumExon 3KidneyMetallothioneinPCR-SSCPPolymorphismPromoterエクソン3カドミウムプロモーター異常メタロチオネイン塩基配列異常腎臓遺伝子多型公衆衛生学・健康科学基盤研究(B)東北大学
展開研究
67000006500000本研究は人間の組織中メタロチオネイン(MT)濃度の個体差を明確にすると共に,その原因を解明することを目的とする。一般的な日本人の腎臓中カドミウム(Cd)濃度は加齢と共に上昇し、それに伴ってMT濃度も増加する。したがって年齢とMT濃度は非常に高い相関性を示すが、法医解剖検体103例について腎臓中のCdおよびMT濃度を測定したところ、この相関にはずれる個体、すなわち中年であるにもかかわらずMT濃度の低い個体が存在することが判明した。そこで、ヒトMTの主要分子種であるMT-IIAの遺伝子プロモータおよび各エクソン(エクソン1〜3)領域について、遺伝子変異の有無をPCR-SSCP法でスクリーニングした。その結果、MT-IIA遺伝子のプロモーター領域では103例中19例において転写開始点より5塩基上流に一塩基置換(A→G)が認められ� �。しかしこの一塩基置換は19例とも片側のアレルにのみに認められ、もう一方は正常のアレルを持つことが確認された。またMT-IIAのexon3領域では103例中5例について一塩基置換(C→T)が認められた。この一塩基置換はコドン42番目のアラニンをバリンに変えるミスセンス変異であることが確認された。またこの一塩基置換は5例とも片側のアレルのみに認められ、もう一方のアレルは正常であることが確認された。さらにこの5例は同時にプロモーター部位にも変異を持つことが確認された。しかし、これらの変異を持つ人々の腎臓中MT濃度は正常範囲であった。したがって、これらの変異はMT蛋白質合成に影響を与えるものではないと考えられる。今後はMT遺伝子の発現制御に関わる転写因子などの異常について検討する必要があろう。

In general Japanese who usually well eat rice containing relatively high concentration of cadmium, renal concentration of cadmium increases with aging because most of the accumulated cadmium remained in the bodies without excreting. It has been known that cadmium induces synthesis of metallothionein, a metal binding protein which reduces toxicity of cadmium, and most of tissue cadmium exists as low toxic complex with metallothionein. We found some Japanese adults with relatively low concentration of metallothionein in the kidney. There is a possibility that the low metallothionein concentration may be induced by genetic disorder. We obtained genomic DNA samples extracted from cortex of kidney of the forensic autopsy samples (103 examples) with written informed consents from the bereaved family of all individuals. By single-stranded conformation polymorphism method and direct sequencing methods, abnormalities of nucleotide sequence of metallothionein gene (exon 1-3) and its promoter region were examined. Single base substitution was found in the promoter region of 19 samples. The substitution observed is A-->G in the 5 bases upstream from the transcription starting point. The mutation (C-->T) in region of exon 3 was also observed in 5 samples. This substitution induces amino acid substitution of Ala-->Vat. All these 5 samples with mutation in exon 3 accompanied with the single base substitution (A-->G) in the promoter described above. However, we could not observed any relationship between these polymorphisms of metallothionein gene and the metallothionein concentration in their kidneys. The low metallothionein concentration observed in Japanese adults may be induced by the reason other than the genetic disorder of metallothionein gene.重金属中毒学のパラダイムシフト20012001佐藤東北大学・大学院・医学系研究科・教授永沼東北大学・大学院・医学系研究科・教授藤田博美北海道大学・大学院・医学系研究科・教授遠山千春国立環境研究所・環境健康部・部長小野坂敏見神戸学院大学・栄養学部・教授吉田聖マリアンナ医科大学・医学部・助教授カドミウムセレンメタロチオネイン交絡因子低濃度曝露感受性水銀衛生学基盤研究(C)東北大学

企画調査
3500000重金属中毒学は、これまで主として産業中毒および公害の健康被害における病態や機序解明の科学として発展し、その成果は産業現場における中毒を激減させ、公害によって混乱した事態を整理し社会的な解決に向けて大きな寄与をしてきた。その反面、社会的な意味で問題が解決すると、科学的中毒学として必要な解明がなされないままになってしまっている。現在、鉛・水銀・カドミウム等のいくつかの金属で、低濃度の曝露の影響について注目されている。鉛の乳児期曝露の高次中枢神経機能における影響に閾値があるのか、魚食集団の胎児期メチル水銀曝露がどのような影響がどのような「量」でおきるのか、また米による低濃度のカドミウム曝露の影響が懸念されている。そこで本研究では、鉛・水銀・カドミウム等の重金属中毒学を総括し、何が足りないのか、今後研究の課題として何を検討すべきなのかを明らかにすることを目的しワークショップを開催した。その結果、病態や機序の解明が重要であることは、これまでと同様であるが、それだけでなく、ことに人における曝露リスクを明らかにすることと、特に低濃度曝露の場合には、交絡因子がなんであるのかを明らかにし、それを含めて、リスクを評価する、つまり感受性が一様でないことを前提とすることが、重要であると指摘された。これには遺伝的多型も含まれる。それをふまえて、各研究者が今後の研究の課題も含む総説を執筆し、文献検索の対象とされる英文のジャーナルThe Tohoku Joumal of Experimental Medicine(Vol.196, Issue 1,2に計10篇、140..ページ、後2篇はこれから掲載予定)に発表した。(734字)
重金属代謝調節による重金属含有抗がん剤の効果増強法の開発19861986井村伸正北里大・薬学部・教授横山正夫虎の門病院・泌尿器科・部長小山裕子北里大学・薬学部・助手永沼北里大学・薬学部・助教授アドリアマイシンシスプラチンビスマスメタロチオネイン制癌剤の毒性軽減特定研究北里大学3800000メタロチオネイン(MT)合成誘導剤の前投与が優れた制がん剤であるシスプラチン(CDDP)およびアドリアマイシン(ADR)の抗腫瘍性を抑制することなく副作用のみを選択的に軽減することを見出した。この方法を臨床で利用することを目的として以下の検討を行った。(1)MT合成誘導剤によるADR毒性軽減機構:MT誘導能を有する次硝酸ビスマス(BSN)を様々な条件でマウスに投与したところ、心臓中MT濃度の高いマウスほどADR投与による死亡率および心臓毒性(脂質過酸化を指標とした)発現率が共に低値を示した。またコロン38結腸癌皮下移植マウスにおいてBSNは腫瘍組織中MT濃度に影響を与えずADRの抗腫瘍効果も抑制しなかった。これに対して心臓中MT濃度に影響を与えずに腫瘍組織中のMTを上昇させる銅の投与はADRの抗腫瘍効果を低下させ、心臓� �性は抑制しなかった。これらの結果から組織中で増加したMTがその組織でのADRの作用を抑制すると考えられる。MTはin vitroでのADRによる【0_2^-】生成を抑制し、またBSNは心臓中で【O_2^-】除去に関与すると考えられるMT以外の因子(スーパーオキシドジスムターゼ等)に影響を与えないことが判明したことから、MTが【0_2^-】などのフリーラジカル除去作用を発揮することによってADRの心毒性を抑制している可能性が考えられる。(2)ADRとCDDP併用時のMT合成誘導剤の効果:BSNの前投与によってCDDPの示す腎毒性およびADRの示す心毒性が同時に著しく軽減され、両制癌剤併用時には両者の副作用が共に抑制されることが判明した。(3)BSN前投与法の臨床検討:尿路性器進行癌にCDDP化学療法を施行した23例を対象にBSN前投与の効果を検討したところ、奏効率は対象群33%、BSN前投与群50%であり、BSN前投与によるCDDPの抗腫瘍効果抑制は認められなかった。またクレアチニンクリアラ� ��スを指標にしたCDDPの腎毒性はBSN前投与によって軽減される傾向にあった。メタロチオネインなど制御可能な生体要因の量的質的調節による各種制癌剤の副作用軽減19871987井村伸正北里大学・薬学部・教授瀬子義幸北里大学・薬学部・講師
jp/ja/r/80155952">永沼北里大学・薬学部・助教授カドミウム耐性細胞フリーラジカルマウスメタロチオネイン制癌剤副作用軽減法放射線次硝酸ビスマスがん特別研究北里大学69000001.動物実験:シスプラチン(CDDP)やアドリアマイシン(ADR)についてその毒性軽減法を検討し, メタロチオネイン(MT)合成誘導剤である次硝酸ビスマス(BSN)がこれらの制癌剤の抗腫瘍性を損なうことなく副作用のみを効率よく軽減することを明らかにしてきた. 昭和62年度の研究では, MT合成誘導剤の投与によって代謝拮抗剤である5ーフルオロウラシルの致死毒性及び骨髄毒性, さらにアルキル化剤であるサイクロフォスファミドのマウスに対する毒性, 並びに放射線の致死作用が軽減されることが明らかとなった. また, ADRによる副作用の標的臓器, 心臓での脂質の過酸化がMT合成誘導剤の前投与によって抑制された. このとき心臓中では, 生体内過酸化防御効果が期待される他の生体内因子(スパーオキサイドディスムターゼ,カタラーゼ,およびグルタチオンペルオキシダーゼの活性ならびにグルタチオン濃度)には変化が認められず, MT濃度のみが増加し, しかも脂質過酸化の抑制程度と有意な相関が認められた. この事からADRの毒性軽減にはMTが重要な役割を果している可能性が強く示唆された.2.培養細胞を用いた研究:100μM Cd添加培地中で継代することにより得たCd耐性細胞株(Hela^r_<100>:MT濃度はCd感受性細胞の約180倍)は, 検討した作用機構の異なる5種類の制癌剤のうちビンブラスチンを除く4種の制癌剤(CDDP,ADR,メルファラン,ペプロマイシン)に対して, それぞれ感受性細胞の2,2,1.5,3倍の耐性(IC_<50>値)を示した. この耐性株においては感受性株に比較して制癌剤の取り込み量の減少は観察されず, また, MT以外のフリーラジカル除去因子の活性, 量においても変動は認められなかった. 以上の結果は, 制癌剤の細胞毒性軽減に於てMTが重要な役割を果している可能性を示している.

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2008年8月25日 ... ・Mobilizing Financial Resources; ... そのため、工事による騒音対策や従業員が生息 地にむやみに入らないように教育することが欠かせない。 ... さらに、「スーパー麹菌」で ある程度まで大まかに分解したセルロースに、「スーパー酵母」を作用させることで、直接 エタノール ..... 具体的に、どのような活動がなされているのでしょう? read more

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